Probenvisualisierung in der Immunohistochemie

Probenvisualisierung in der Immunohistochemie

Nach der Inkubation mit dem Primärantikörper kann die Färbung mit einer Reihe von Detektionsmethoden visualisiert werden. Die Detektion kann direkt oder indirekt erfolgen und die Signalgenerierung kann chromogen oder fluoreszent sein.

Direkte im Vergleich mit indirekter Detektion

Bei der direkten Detektion ist die Markierung im Primärantikörper enthalten, bei der indirekten Detektion hingegen im Sekundärantikörper.  Die Wahl der Detektionsmethode ist vom Expressionsniveau des Antigens abhängig. Da markierte Primärantikörper eine relativ geringe Signalgenerierung aufweisen, sind sie für hochgradig exprimierte Antigene geeignet. Eine direkte Detektion empfiehlt sich auch für Experimente mit Mehrfachfärbung. Mittelstark exprimierte Antigene zeigen das beste Signal, wenn sie mit einem markierten Sekundärantikörper analysiert werden, der die Signalintensität verstärkt. Bei der indirekten Färbung kommt es stets zu höheren Hintergrundgeräuschen. Für Proteine mit extrem niedriger Expression hilft indirekte Detektion plus Enhancer (z.B. Avidin, Streptavidin), um das Signal zusätzlich zu verstärken. Diese Art der Detektion erfordert häufig zusätzliche Optimierungsschritte, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten.

Unterschiedliche Detektionssysteme und Signalverstärkung

Chromogene im Vergleich mit fluoreszenter Signalerzeugung

Ein Signal wird von Fluorophoren oder Enzymen generiert. Die Detektionsmethode und das verfügbare Mikroskop sind maßgeblich bei der Wahl der Markierung.

Wenn Sie mit fluoreszenten Markierungen arbeiten, kann der Fluorophor entweder mit dem Primär- oder Sekundärantikörper konjugiert werden. Besonders bei Färbungsexperimenten mit mehreren Farben sind fluoreszente Markierungen nützlich, um verschiedene Zellkompartimente gleichzeitig zu erkennen. Ein Nachteil von Fluorophoren ist ihre kurze Lebensdauer. Diese ist auch der Grund dafür, weshalb bei der Visualisierung von Gewebefärbungen häufig Enzym-Marker zum Einsatz kommen.

Diese Enzym-Marker haften am Primär- oder Sekundärantikörper und bilden nach Hinzufügen eines organischen Substrats ein nicht lösliches, farbiges Produkt. Die am häufigsten eingesetzten Enzym-Marker sind Meerrettich-Peroxidase und alkalische Phosphatase.