IHC- Antigenrückgewinnung

Was ist die Antigenrückgewinnung?

Als Antigenrückgewinnung wird die Technik bezeichnet, die in den meisten mit Formalin fixierten Geweben vor der immunohistochemischen Färbung erforderlich ist. Die Antigenrückgewinnung wird verwendet, um die Epitopmaskierung rückgängig zu machen und die Epitop-Antikörper-Bindung wiederherzustellen, die während des Fixationsvorgangs häufig verloren geht.  Wird dieser Schritt ausgelassen, kann dies zu einer schwachen oder falsch negativen Färbung führen.

Manche Fixationsmittel können Epitope maskieren und die Antigen-Antikörper-Bindung reduzieren. Durch die Antigenrückgewinnung kann die Antigenität des Gewebes wiederhergestellt werden. Die Antigenrückgewinnung wird üblicherweise vor der Einfärbung durchgeführt, um versteckte oder denaturierte Ziel-Epitope zu demaskieren. Die Antigenrückgewinnung kann Hitze-induziert oder enzymatisch erfolgen, mit Faktoren wie Temperatur, ph-Wert und Dauer. Welche Methode anzuwenden ist, hängt von der Gewebeart und dem Primärantikörper ab.

Grundsätzlich gibt es zwei Methoden der Antigenrückgewinnung: Hitze-induzierte Epitoprückgewinnung (HIER) und Protease-induzierte Epitoprückgewinnung (PIER). Welche Methode anzuwenden ist, hängt von der Gewebeart und dem Primärantikörper ab.

Hitze-induzierte Epitoprückgewinnung (HIER)

Die Hitze-induzierte Epitop-Antigenrückgewinnung wird durchgeführt, indem der Schnitt für eine gewisse Zeit in einem spezifischen Puffer erhitzt wird.  Dies kann mittels Mikrowelle, Drucktopf, Wasserbad, Dampfgerät etc. erfolgen. Der am häufigsten verwendete Puffer ist Zitratpuffer (siehe Rezept in allgemeinen Immunohistochemie-Protokollen). Die Wahl des Puffers hängt jedoch vom jeweiligen Antikörper ab. Bitte beachten Sie die auf dem Datenblatt angeführten Anweisungen bzw. Empfehlungen für den Puffer. Als Faustregel gilt, dass ein EDTA-Puffer günstiger für Arbeiten mit Antikörpern gegen Phosphotyrosine ist.

Protease-induzierte Epitoprückgewinnung (PIER)

Bei der Protease-induzierten Epitoprückgewinnung (PIER) werden Epitope von Peptidasen demaskiert.

Trypsin ist ein beliebtes Enzym, das die Proteinvernetzungen aufbricht, das versteckte Antigen sichtbar macht und so die Intensität der Färbung sowie die Spezifität des Primärantikörpers erhöht.

1. Bereiten Sie das Trypsin vor und erhitzen Sie es auf 37°C. Pipettieren Sie die Enzymlösung auf den Schnitt.

2. Platzieren Sie die Objektträger in einem befeuchteten Behälter und stellen Sie diesen in den auf 37°C vorgeheizten Inkubator.

3. Entfernen Sie nach 15 Minuten die Objektträger aus dem Inkubator und transferieren Sie sie auf ein Rack in einem Behälter mit Leitungswasser. Spülen Sie sie 3 Minuten lang mit fließendem Wasser.

4. Fahren Sie mit der immunohistochemischen Färbung fort. (Andere verwendete Enzyme sind Proteinase k, Pepsin, Protease oder Pronase).

Hitze-induzierte Epitoprückgewinnung (HIER) im Vergleich mit Protease-induzierter Epitoprückgewinnung (PIER)