Auswahl von Antikörpern für die Immunhistochemie

Auswahl und Optimierung von Antikörpern für IHC

Wenn Sie sich für einen Antikörper entscheiden, sollten Sie folgende Punkte beachten, um die Wahrscheinlichkeit einer hohen Spezifität und niedrigen Kreuzreaktion sowie einer erfolgreichen Färbung zu erhöhen. Eine zusätzliche Optimierung wird empfohlen, um ein verlässliches Signal zu gewährleisten: Ziehen Sie dafür einschlägige Literatur und Ressourcen zu Rate, die Antikörper vergleichen. Konsultieren Sie die internen Validierungsdaten des Anbieters Ihrer Antikörper, suchen Sie nach unabhängigen Validierungsdaten und halten Sie mit dem Originalhersteller Rücksprache, falls Sie technischen Support bzw. Hilfe mit Ihrem Protokoll benötigen.

Auswahl des Primärantikörpers für IHC

Die anfängliche Auswahl Ihres Primärantikörpers kann das Ergebnis des gesamten Experiments beeinflussen. Es ist daher wichtig, dass Sie sich für einen ausreichend validierten Antikörper entscheiden, um die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Experiments zu erhöhen. Besonders wichtig ist in diesem Zusammenhang, den Antikörper vom Originalhersteller zu beziehen und nicht von einem Drittanbieter, da nur der Originalhersteller Zugang zu den Validierungsdaten hat und Ihnen eine ausreichende technische Unterstützung bieten kann.

Die Fragen, die Sie bei der Auswahl Ihres Antikörper-Anbieters stellen sollten

Polyklonale im Vergleich mit monoklonalen Antikörpern

Zu guter Letzt müssen Sie sich auch überlegen, ob monoklonale oder polyklonale Antikörper für Ihre Zwecke besser geeignet sind. Bei IHC werden generell mit polyklonalen Antikörpern bessere Ergebnisse erzielt.

Vorteile von polyklonalen Antikörpern bei IHC

• Heterogene Population.

• Erkennen mehrere Epitope.

• Stabil auch bei veränderten Bedingungen (pH, Gewebe, Puffer, Proteinbestätigung); stabile Erkennung.

Nachteile von polyklonalen Antikörpern bei IHC

• Nicht spezifisch gegenüber einem Epitop.

Vorteile von monoklonalen Antikörpern bei IHC

• Homogene Population.

• Spezifisch gegenüber einem Epitop.

• Erkennt ein einziges Protein mit hoher Affinität, auch wenn sich dieses Protein Sequenzen mit anderen Proteinen teilt bzw. Ähnlichkeiten mit diesen aufweist.

Nachteile von monoklonalen Antikörpern bei IHC

• Sensibel auch gegenüber geringfügig veränderten Bedingungen (pH, Gewebe, Proteinbestätigung); keine stabile Erkennung.

Optimierung des Primärantikörpers für IHC

Die optimalen Bedingungen für den Primärantikörper hängen vom individuellen Experiment ab und müssen daher optimiert werden, um eine qualitativ hochwertige Färbung zu gewährleisten.

Allgemeine Schritte für die Optimierung des Primärantikörpers bei IHC

• Optimieren Sie die Inkubationszeit und Temperatur; titrieren Sie verschiedene Antikörperverdünnungen.

• Spezifische Färbung, aber Hintergrundsignal: Variieren Sie für kurze Zeit die Inkubationszeit und Temperatur. 

• Hoch affiner Antikörper mit hoher Konzentration: Inkubation mit hoher Konzentration für kurze Zeit. 

• Hoch affiner Antikörper mit niedriger Konzentration: Verlängern Sie die Inkubationszeit, reduzieren Sie die Inkubationstemperatur.

• Generell können polyklonale Antikörper bei einer höheren Arbeitsverdünnung eingesetzt werden als monoklonale Antikörper.

Auswahl und Optimierung von Sekundärantikörpern für IHC

Bei immunohistochemischen (IHC) Anwendungen kann eine Reduzierung des Signal-Rausch-Verhältnisses bei der Unterscheidung von Antikörper-Unterklassen, Aufreinigungen und Fragmenten des Sekundärantikörpers von Vorteil sein.

Subklasssen-Spezifität

Polyklonale Primärantikörper sind hauptsächliche IgG-Isotypen. Monoklonale Primärantikörper haben gelegentlich einen anderen Isotyp und brauchen daher einen Isotypen-spezifischen Antikörper.

Kreuzabsorption

Sekundärantikörper können einen zusätzlichen Aufreinigungsvorgang durchlaufen, um eine potentielle Kreuzreaktion mit anderen Spezies zu reduzieren. Dafür wird die Sekundärantikörperlösung über verschiedene Säulen geführt, die Serenproteine unterschiedlicher Spezies enthalten, um den nicht-spezifischen Sekundärantikörper herauszufiltern.

F(ab’)₂-Fragmente

Eine hohe Hintergrundfärbung kann auf das Vorhandensein von Fc-Rezeptoren in besonderem Gewebe oder in Zellen zurückzuführen sein.

Tipp: Wenn es sich beim Primärantikörper um ein Fragment handelt, sollte auch der Sekundärantikörper fragmentspezifisch sein, um das Rauschsignal zu reduzieren (F(ab’)₂-Fragment-Sekundärantikörper dringen bei IHC leichter in das Gewebe ein).

IHC-Kontrollen

Die Durchführung von Kontrollfärbungen ist wichtig, um sicherzustellen, dass das beobachtete Färbungsmuster spezifisch und authentisch ist und nicht z.B. auf Kreuzreaktionen oder nicht-spezifische Bindungen zurückzuführen ist.

Positivkontrollen

• Kontrollgewebe, von dem man weiß, dass es das zu untersuchende Protein exprimiert, beweist, dass das Färbeprotokoll und der Antikörper richtig funktionieren.

Negativkontrollen

• Kontrollgewebe, von dem man weiß, dass es das zu untersuchende Protein nicht exprimiert, beweist, dass das beobachtete Färbungsmuster durch spezifische Signale entstanden ist.

• Inkubieren Sie das Gewebe nur mit dem Sekundärantikörper. Diese Kontrolle stellt sicher, dass keine Kreuzreaktionen oder nicht-spezifische Hintergrundsignale beobachtet werden, die auf den Sekundärantikörper und die Erkennungsreagenzien zurückzuführen sind.

• Die Betrachtung des nicht gefärbten Gewebes unter dem Mikroskop im Hellfeld-/Fluoreszenzkanal liefert ein Bild des biologischen Hintergrundsignals/der Autofluoreszenz, die hauptsächlich auf Mitochondrien, Lyosome und aromatische Aminosäuren zurückzuführen sind und mit positiver Färbung verwechselt werden könnten.

• Die Inkubation des Gewebes mit einem nicht-immunen Immunoglobulin vom selben Isotyp stellt sicher, dass die beobachtete Färbung nicht auf die nicht-spezifische Bindung von Immunoglobulinen zurückzuführen ist.