WIE SIE IHRE ELISA-EXPERIMENTE OPTIMIEREN
Technische Tipps für bessere ELISA-Ergebnisse
Einführung in ELISA
Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist eine der empfindlichsten und reproduzierbarsten der verfügbaren Techniken. Diese Assays sind schnell, einfach durchzuführen und leicht zu automatisieren. Wie bei jedem Assay hängt die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit von ELISAs von der richtigen Technik und Detailgenauigkeit ab.
Die ELISA-Technik ist unterteilt in:
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Direkter ELISA, bei dem das Antigen auf der ELISA-Platte immobilisiert ist und der primäre Antikörper die Markierung trägt (Abbildung 1 A).
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Indirekter ELISA, bei dem das Antigen auf der ELISA-Platte immobilisiert ist und der sekundäre Antikörper die Markierung trägt (Abbildung 1 B).
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Sandwich-ELISA, bei dem zwei primäre Antikörper (zum Einfangen und Nachweis) das Antigen einbetten, ein "Sandwich" bilden und anschließend der Komplex von einem sekundären markierten Antikörper erkannt wird (Abbildung 1 C).
Abbildung 1. ELISA-Arten: A) direkt, B) indirekt und C) Sandwich ELISA.
Gematchte Antikörperpaare im ELISA-Kit
„Gematchte Paare“ bezieht sich auf Antikörper-Sets, von denen bekannt ist, dass sie unterschiedliche Epitope auf dem gleichen Protein-Antigen erkennen, so dass sie zusammen zum Einfangen und Nachweis eines einzelnen Antigens in einem Sandwich-ELISA verwendet werden können. Die in ELISA-Tests verwendeten Antikörper können monoklonal, polyklonal oder beides sein.
Monoklonale Antikörper können für sämtliche Antikörper-enthaltenen Schritte in allen Arten von ELISAs verwendet werden. Sie werden üblicherweise in Sätzen als übereinstimmende Paare in Sandwich-ELISAs verwendet, können aber zum Einfangen oder Nachweis in Verbindung mit einem polyklonalen Antikörper verwendet werden, um das Signal zu verstärken oder um die Chance zum Einfangen eines Antigens aus einer komplexen Lösung zu erhöhen.
Aufgrund der Heterogenität von Antikörpern, die in polyklonalen Antikörperlösungen vorhanden sind, und der breiten Darstellung vorhandener Epitope können polyklonale Antikörper leistungsfähige Werkzeuge zum Nachweis eines Antigens sein, da sie oft höhere Signalpegel ergeben als monoklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper teilen jedoch eher ein oder mehrere Epitope mit eng verwandten Proteinen, was zu einem höheren unspezifischen Signal führt. Eine Möglichkeit zur Verringerung dieses Problems besteht darin, affinitätsgereinigte oder kreuzadsorbierte polyklonale Antikörper zu verwenden. Um die Assayempfindlichkeit zu erhöhen, kann das Nachweisverfahren für einen ELISA von einem direkten zu einem indirekten Nachweis unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers umgestellt werden.
ELISA-Proben
Eine Vielzahl von Proben kann in einem ELISA getestet werden. Die Wahl der Testbedingungen hängt von der Komplexität der Probe und der erwarteten Menge an vorhandenem Antigen ab.
Es ist wichtig, alle Proben doppelt oder dreifach in Verbindung mit einem bekannten Standard zu testen um die Genauigkeit der Ergebnisse und die Quantifizierung sicherzustellen.
Es ist besser, mehrere Verdünnungen einer Probe zu testen um sicherzustellen, dass die Endergebnisse in den linearen Teil der Standardkurve fallen. Hochkonzentrierte Proben können die Konzentration unterschätzen, während stark verdünnte Proben die Konzentration überschätzen können.
ELISA-Blockierungs- und Waschschritte
Ein Blockieren ist oft notwendig um eine unspezifische Bindung von Nachweisantikörpern an die Oberfläche der Mikrotiterplatte selbst zu verhindern. Wenn eine Platte vollständig blockiert ist, wird die Testsensitivität verbessert, da das unspezifische Signal reduziert wird.
Ein gründliches Waschverfahren ist notwendig um zuverlässige ELISA-Ergebnisse zu erhalten. Es ist wichtig, die Flüssigkeit aus allen Vertiefungen vollständig abzusaugen, indem Sie die Saugspitze vorsichtig in den Boden senken. Vermeiden Sie Kratzer im Inneren des Näpfchens. Wenn das Waschen beendet ist wird empfohlen, die Platte umzudrehen und auf einem saugfähigen Labortuch zu trocknen.
Wie Sie Ihr ELISA Experiment optimieren
Obwohl jede Komponente separat beschrieben wird, ist es in vielen Fällen möglich zwei Komponenten gleichzeitig zu optimieren indem eine Schachbrett-Titration durchgeführt wird.
1) Konzentration des Fang-Antikörpers
• Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen des Fang-Antikörpers im Beschichtungspuffer vor.
• Bereiten Sie verschiedene Blockierungslösungen vor. Wenn die Blockierungslösung nicht vorformuliert ist (d.h. es ist ein einzelnes Protein, wie BSA) versuchen Sie verschiedene Konzentrationen des Proteins.
3) Das Standardverdünnungsmittel
• Versuchen Sie, das Standard-Verdünnungsmittel so genau wie möglich an die Matrix der Probe anzupassen.
• Wenn die Matrix selbst nicht exakt dupliziert werden kann, testen Sie verschiedene Standard-Verdünnungslösungen und überprüfen Sie die Standardkurve und die Linearität der Verdünnung für die Probe. Es kann erforderlich sein ein anderes Verdünnungsmittel zu wählen.
• Wenn die Probe eine schlechte Linearität aufweist, besteht möglicherweise ein Ungleichgewicht zwischen der Probenmatrix und dem Standardverdünnungsmittel. In solchen Fällen sollten Spike-and-Recovery- oder Linearitäts-Verdünnungs-Experimente durchgeführt werden.
• Bereiten Sie unterschiedliche Konzentrationen der Probe vor, wobei Sie die Nachweisgrenze des Substrats beachten müssen. Um zu bestätigen, dass die biologische Probenmatrix das Signal nicht maskiert oder verstärkt, sollten Spike-and-Recovery- und Linearitäts-Verdünnungsexperimente durchgeführt werden.
5) Die Nachweisantikörperkonzentration
• Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen des Nachweisantikörpers vor.
6) Die Enzymkonjugat Konzentration
• Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen des Enzymkonjugats gemäß dem für das Substrat beschriebenen ELISA-Kit vor.
• Wählen Sie das / die Substrat(e) basierend auf der Menge des Antigens in der Probe und der Fähigkeit, es mit einem Plattenlesegerät zu erkennen.
• Wenn das Antigen eindeutig nachgewiesen werden kann, ist das Substrat geeignet.
• Wenn das Antigen unter der Nachweisgrenze liegt, wählen Sie ein empfindlicheres Substrat.
Übliche ELISA-Probleme
1) Schwaches oder kein Signal im ELISA
• Es wird empfohlen, alle Reagenzien vor Beginn des Tests für 15-20 Minuten bei Raumtemperatur zu lagern.
• Falsche Lagerung von Komponenten. Überprüfen Sie die Lagerbedingungen auf dem Etikett des Kits. Die meisten Kits müssen bei 2-8 ° C gelagert werden.
• Reagenzien hinzugefügt / falsch vorbereitet. Überprüfen Sie das Protokoll. Stellen Sie sicher, dass die Reagenzien in der richtigen Reihenfolge hinzugefügt und auf die richtige Verdünnung vorbereitet wurden.
• Überexposition von fluoreszierenden Reagenzien. Intensives Licht kann durch Zersetzung des Fluorophors zu Photobleichung führen. Der Schutz des Fluorophors vor Licht ist für eine effektive Signalerzeugung am Ende des Assays wesentlich.
• Komponenten müssen weiter optimiert werden. Eine der Komponenten des Assays kann eine Grenzkonzentration aufweisen, was zu einem niedrigeren Gesamtsignal führt.
• Abbau von Reagenzien. Eines der Reagenzien ist möglicherweise abgebaut oder kontaminiert. In diesem Fall sollte es ersetzt werden.
• Die Antikörper sind ein ineffizientes Paar oder haben keine ausreichende Affinität zum Ziel. Die verwendeten Antikörper binden möglicherweise nicht wirksam an das Antigen oder funktionieren möglicherweise nicht in Kombination miteinander. In solchen Fällen müssen alternative Antikörper getestet werden.
• Erkennungssystem erfordert weitere Optimierung. Das Detektionssystem (Substrat) ist möglicherweise nicht empfindlich genug, um das Signal anzuzeigen, oder die Standardkurve ist möglicherweise für die Probe nicht geeignet. Es kann notwendig sein, die Probe zu konzentrieren oder auf ein empfindlicheres Substrat umzuschalten.
• Unzureichendes Waschen oder Blockieren. Ein hohes Hintergrundsignal ist üblicherweise das Ergebnis eines unzureichenden Waschens oder Blockierens von Probenkomponenten oder Antikörpern, die mit dem Blockierungspuffer kreuzreagieren oder der Verwendung von zu viel Enzymkonjugat.
• Es ist wichtig die Menge an Enzymen auszugleichen, die ein spezifisches Signal ergeben gegenüber denen, die ein Hintergrundsignal ergeben. Der effektivste Weg es zu kontrollieren ist die Optimierung des Enzymkonjugats, der Antikörper und der Blockierungslösung.
3) Geringe Linearität der Standardkurve
• Wenn die Standardkurve eine schlechte Linearität aufweist, müssen die Proben in einen engen Konzentrationsbereich fallen, um als genau zu gelten.
• Wenn die Kurve eine gute Linearität aber eine geringe Variation zwischen Replikaten (d.h. Standardfehler) aufweist, könnte es an einem technischen Problem wie inkonsistenten Pipettieren zwischen den Proben oder den einzelnen Benutzern liegen.
Alle Proben und Standards sollten mindestens doppelt oder dreifach gemessen werden um dieses Problem zu beheben.
• Unzureichendes Waschen. Um dieses Problem zu vermeiden, verwenden Sie die geeignete Waschprozedur. Drehen Sie z.B. am Ende eines jeden Waschschritts die Platte um und lassen Sie sie auf saugfähigem Labortüchern vollständig ablaufen. Klopfen Sie gegebenenfalls kräftig dagegen um eventuell verbliebene Flüssigkeit zu entfernen.
• Inkubationszeit ist zu lang. Übermäßige Inkubationszeit ist auch ein Grund für zu hohe Signale im ELISA. Beachten Sie unbedingt die empfohlenen Inkubationszeiten.
• Kontamination. Vermeiden Sie dieses Problem mit Verschlussmatten und verwenden Sie jedes Mal, wenn die Platte geöffnet wird, eine frische Versiegelung. Dies verhindert, dass sich die Wells gegenseitig verunreinigen.