Lysat Vorbereitung: Warum ist der RIPA Puffer der Beste Puffer für Western Blot?

Im Jahr 1979 veröffentlichte Jaime Renart et al. einen Artikel mit dem Titel " Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure", der Auftakt der modernen Western Blot (WB) -Technik.

Bald darauf ging Harry Towbin et al. einen Schritt weiter und veröffentlichte " Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications." Das ist die offizielle Geburtsstunde der WB-Technik.

Heute sind WB-Experimente ein Eckpfeiler der biologischen Forschung. Leider ist es häufig eine Herausforderung, gute Ergebnisse zu erzielen.

Ein weiser Mann sagte einmal:

Ein erfolgreicher WB beruht auf: 10% Reagenzien 10% Ausführung 10% Glück 70% Proteinextraktion.

Als originaler Hersteller all unserer Produkte, testen die F&E Mitarbeiter von Proteintech durchschnittlich mehr als 70 Proben für jedes Produkt in WB. Die Senior F&E Mitarbeiter von Proteintech teilen gerne mit Ihnen ihre  jahrelange Erfahrung mit WB um sicherzustellen, dass jedes WB ein Erfolg ist.

Was enthält eine Lysis-Lösung?

Eine Lysis-Lösung enthält folgende Komponenten:

1. Das Puffersystem

Der pH-Wert der Lösung ist kritisch. Proteine können ausfallen oder instabil werden, wenn der pH-Wert außerhalb des physiologischen Bereichs liegt. Um dies zu vermeiden, wird ein Puffersystem wie Tris-HCl empfohlen. Neben Pufferlösungen in diesem Bereich erhält ein Tris-HCl-Puffer die physiologische Ionenstärke und verhindert die Bildung von unlöslichen Produkten mit anderen Ionen. Ein HEPES-Puffersystem ist eine weitere Möglichkeit. Wir empfehlen, Puffer mit hohen Kaliumkonzentrationen zu vermeiden, da diese Proteine fällen können, wenn Natriumdodecylsulfat (SDS) vorhanden ist.

2. Salzionen

Wenn die Salzionenkonzentration zu hoch ist, können einige Proteine ausfallen. Wenn die Ionenkonzentration zu hoch ist, kann darüber hinaus ein "Smiley-Gesicht" der Bandenwanderung entstehen.

3. Chaotrope Mittel

Chaotrope Mittel schwächen die Hydrophobie der Proteine, um sie zu solubilisieren. Es gibt zwei Arten von chaotropen Mitteln in einem Lysepuffer:

a. Harnstoff / Thioharnstoff. Diese Moleküle lösen hydrophobe Regionen auf, indem sie Wasserstoffbrücken zwischen Aminosäuren unterbrechen. Wenn eine Proteinextraktion für ein WB durchgeführt wird, können üblicherweise WB, 6­–8M Harnstoff und/oder 2M Harnstoff und/oder 2 M Thioharnstoff verwendet werden.

b. Reinigungsmittel. Das ist eine breite Klasse von Tensiden. Der Schlüssel zu ihrer solubilisierenden Kraft ist ihre amphiphile Struktur. Das hydrophobe Ende bindet an die hydrophoben Teile der Proteine, während das hydrophile Ende mit Wasser interagiert, was zur Solubilisierung führt.

Ionische Detergenzien können weiter in kationische, anionische und amphotere Detergenzien unterteilt werden. Gemeinsame ionische Tenside sind SDS, DOC (Natriumdeoxycholat) und SLS (Natriumlaurylsarcosin). Übliche amphotere Tenside sind CHAPS (3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat) und CHAPSO (3 - [(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxy-1-propansulfonat). Übliche nichtionische Tenside sind Triton X-100, Triton X-114, Tween-20 und NP40.

Hinweis: In einem WB ist entscheidend, dass die Anzahl der negativ geladenen SDS-Moleküle, die an ein Protein binden, proportional zur Masse des Proteins ist, so dass die Migrationsrate nur durch die Masse beeinflusst wird. Die Zugabe von kationischen Tensiden in dem Lysepuffer würde die SDS-Protein-Wechselwirkung unterbrechen und die Proteine in die entgegengesetzte Richtung wandern lassen.

Aufgrund der Komplexität der Proteinbiochemie ist es schwierig das optimale Tensid für die Extraktion eines bestimmten Proteins vorherzusagen. Daher wird das Experimentieren mit verschiedenen Tensiden empfohlen, wenn Probleme auftreten. Dies wird besonders für Membranproteine empfohlen.

4. Proteaseinhibitoren

Gewebe und Zellen enthalten oft große Mengen an Proteasen. Während der Lyse werden diese freigesetzt und können das Zielprotein wiederum verdauen. Daher sind Proteaseinhibitoren kritisch für die Konservierung des Zielproteins. Gängige Proteaseinhibitoren sind PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin und AEBSF-HCL (4-Benzolsulfonylfluoridhydrochlorid). PMSF ist sehr effektiv und die beliebteste Wahl für die Lysatherstellung.

Viele Proteaseinhibitoren benötigen ein zweiwertiges Metallion um zu funktionieren, so dass ein Sequestrierungsmittel häufig auch verwendet wird um Proteaseaktivität zu hemmen, wie EDTA. Zusätzlich wird für phosphorylierte Zielproteine ein Phosphataseinhibitor wie Natriumfluorid oder Natriumorthovanadat benötigt um die phosphorylierte Form des Proteins zu erhalten. Insbesondere Natriumorthovanadat ist sehr wirksam, muss jedoch aktiviert werden indem der pH-Wert der Lösung auf 10 eingestellt und dann gekocht wird bis die Lösung farblos ist. Andere Phosphataseinhibitoren umfassen Natriumpyrophosphat und β-Glycerinphosphat.

5. Reduktionsmittel

Viele Proteine existieren in Multimeren durch Disulfidbindungen. Reduktionsmittel stören diese Bindungen, so dass die extrahierten Proteine in monomerer Form vorliegen. Übliche Reduktionsmittel sind DTT (Dithiothreitol) und BME (Beta-Mercaptoethanol). Unter Berücksichtigung all dessen sind RIPA-Puffer die beste Wahl für die Probenlysatpräparation. Wir haben über 13.000 Antikörper im WB validiert und immer wieder die besten Ergebnisse mit RIPA-Puffer erzielt. Im Laufe der Jahre haben wir den Puffer verfeinert. Unten finden Sie die optimierte Version von Proteintech:

Wenn Probleme bei der Extraktion des konventionellen Lysatproteins auftreten, empfehlen wir Ihnen, besser in der Fachliteratur nachzuschlagen als wahllos verschiedene Extraktionskits auszuprobieren.