LADUNGSKONTROLL-ANTIKÖRPER FÜR WESTERN BLOTTING

Die Proteine und Peptide, die regelmäßig als endogene oder exogene Kontrollen dienen, stehen vielleicht nicht immer im Mittelpunkt Ihrer Forschung, sind aber unverzichtbar für die Durchführung aussagekräftiger Experimente und sind für eine Veröffentlichung unerlässlich.

Western Blotting erfordert solche Kontrollen: Weitverbreitet ist die Verwendung zur Semi-Quantifizierung von Proteingehalten unter einer Reihe von verschiedenen experimentellen Parametern. Proteinstandards sind erforderlich um Western-Blotting-Ergebnisse sinnvoll zu machen und zu überprüfen, ob Erhöhungen oder Abnahmen von Zielproteinen tatsächlich auf experimentelle Manipulationen zurückzuführen sind und nicht beispielsweise, weil die Probe während der Gel-Beladung wandern ging. Interne Kontrollproteine, d.h. solche mit konstantem, unveränderlichem Expressionslevel, werden üblicherweise in einer zweiten Runde des Blottings - nach dem primären Nachweis des interessierenden Proteins - nachgewiesen. Dieser Schritt wird verwendet um Ergebnisse zu standardisieren und Fehler zu normalisieren, die sich in ein Western-Blot-Experiment einschleichen, wie zum Beispiel dem Probenverlust durch das Laden bei SDS-PAGE oder Western-Blot-Transfer.

Kandidaten für die Beladungskontrolle für Western Blotting sind üblicherweise Proteine mit hoher und konstitutiver Expression. Wie oben erwähnt, besteht das grundlegendste Kriterium für eine Ladesteuerung darin, dass ihr Niveau während eines gesamten Experiments unverändert bleibt – unabhängig davon welche Gewebe oder Zelltypen verwendet werden und wie sie gehandhabt werden. Dies bedeutet: Kontrollkandidaten erfordern eine sorgfältige Auswahl. Selbst Bastionen des Ladekontroll-Repertoires - wie β-Actin und α-Tubulin - können von den Bedingungen Ihres Experiments beeinflusst werden. Überprüfen Sie also unbedingt, ob die von Ihnen gewählten Manipulationen keine Auswirkungen haben.

Nachfolgend geben wir Ihnen Hintergrundinformationen zu den internen Kontrollproteinen, ausgerichtet auf Kontrollantikörper die wir Ihnen anbieten, um Ihnen dabei zu helfen, die bestmöglichen Kontrollantikörper für Ihre persönlichen Bedürfnisse auszuwählen.

COX-4

Typ: Mitochondrial

Molekulargewicht: 17 kDa

COX-4 oder COXIV (Cytochrom-c-Oxidase-Untereinheit IV) ist eine Kern-codierte Untereinheit des menschlichen Mitochondrien-Atmungskettenenzyms Cytochrom-c-Oxidase (COX). Die COX-4-Untereinheit kann als eine von zwei Isoformen, Isoform 1 und 2, COX4I1 bzw. COX4I2 genannt, exprimiert werden. Die COX4I1-Expression ist in allen Geweben ubiquitär, während COX4I2 lungenspezifisch ist. Aufgrund seiner hohen Konzentration wird COX4I1 häufig als effektive Ladungskontrolle für mitochondriale Proteine nachgewiesen. Es ist jedoch Vorsicht geboten, wenn dieses Protein für die Western-Blot-Detektion ausgewählt wird. Da viele andere Proteine während der SDS-PAGE bei seiner 17 kDa-Höhe laufen. Stellen Sie sicher, dass Ihre interessierende Bande nicht verdeckt wird. Es ist auch ratsam zu überprüfen, ob nicht experimentelle Manipulationen seine Niveaus beeinflussen. Für eine alternative Kontrolle der Mitochondrienproteinbelastung sehen Sie sich den untenstehenden Eintrag zu VDAC1 an.

Der COX4I1-Antikörper von Proteintech (11242-1-AP) wurde gegen ein COX4I1-Gesamtprotein-Antigen (Aminosäuren 1-169) entwickelt und erkennt auch COX4I2.

Aktin

Typ: Ganze Zelle / Zytoplasma

Molekulargewicht: ~42 kDa

Die sechs Isoformen von Aktin bilden eine Familie hochkonservierter globulärer Proteine, die aus drei Haupt-Isoformgruppen (Alpha, Beta und Gamma) bestehen. Die Alpha-Actins - Alpha C1 und Alpha 1 und 2 - sind ein Hauptbestandteil des kontraktilen Apparats in Muskelgeweben. Die Beta (β) - und Gamma 1- und 2 (γ 1- und γ 2) -Actine existieren in den meisten Zelltypen nebeneinander und sind ein integraler Teil des Cytoskeletts. Sie sind Mediatoren von Zelltransport, struktureller Integrität und Zellmotilität. Zusammen sind die Aktine die am häufigsten vorkommenden Proteine in der typischen eukaryotischen Zelle und machen in einigen Zelltypen etwa 15 Prozent des Gesamtproteins aus. Als solches wird Actin weithin als interne Kontrolle in Western-Blotting-Experimenten verwendet.

Western-Blot-Analyse von ACTB in multiplen Zelllinien- und Gewebelysaten unter Verwendung von Maus-Monoklonalen Anti-Beta-Aktin (60008-1-Ig) in einer Verdünnung von 1: 5000.

Der polyklonale ACTB-Antikörper von Proteintech (20536-1-AP) wurde unter Verwendung eines β-Actin-Proteinantigens (Aminosäuren 14-167) erzeugt und erkennt alle Formen von Aktin, was es zu einem Pan-Aktin-Antikörper macht. Viele Studien verwenden β-Aktin-Antikörper, die sämtliche Aktin-Isoformen erkennen, um nach diesem Ladungskontroll-Kollektiv zu forschen. Wenn Ihre Studien jedoch Arbeiten mit Skelettmuskelproben umfassen oder wenn Sie mit Bedingungen arbeiten, die Veränderungen des Zellwachstums oder veränderte Wechselwirkungen mit der extrazellulären Matrix zeigen, kann eine andere Belastungskontrolle besser auf Ihre Bedürfnisse abgestimmt sein.

HeLa-Zelllysat (10 μg / Spur) wurde durch SDS-PAGE getrennt, und Actin wurde durch Anti-ACTB-Antikörper 20536-1-AP bei unterschiedlichen Verdünnungen nachgewiesen. (L-R) 1: 500, 1: 1.000, 1: 2.000 und 1: 4.000.

GAPDH

Typ: Ganze Zelle / zytoplasmatisch

Molekulargewicht: 36 kDa

Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, allgemein bekannt als GAPDH, katalysiert den sechsten Schritt der Glykolyse. Es beteiligt sich auch an nuklearen Ereignissen wie Transkription, RNA-Bindung und Transport, DNA-Replikation und -Reparatur sowie Apoptose. Seine Expression ist in den meisten Geweben und Zelltypen hoch und konstant, wodurch das Gen und sein Protein-Haushalt erhalten werden. Aus diesem Grund wird GAPDH üblicherweise als eine Proteinladungskontrolle in Western Blotting und interner Kontrolle für RT-PCR verwendet. Die Menge der GAPDH-Expression kann jedoch bei einigen Geweben unterschiedlich sein und die Eignung für Ihr Experiment sollte berücksichtigt werden, bevor dieses Ziel als Kontrolle ausgewählt wird. Es sollte nicht unerwähnt bleiben, dass einige physiologische Faktoren, wie z.B. Hypoxie und Diabetes, die GAPDH-Expression in bestimmten Zell- und Gewebetypen erhöhen.

Proteintech verfügt sowohl über monoklonale GAPDH (60004-1-Ig) als auch über polyklonale GAPDH (10494-1-AP) Antikörper, die beide gegen ein Vollprotein-Antigen (Aminosäuren 1-335) humanen Ursprungs erzeugt wurden.

Western Blot mit Hela-Zelllysat unter Verwendung von Anti-GAPDH (10494-1-AP) in verschiedenen Verdünnungen (L-R: 1: 2000, 1: 4000, 1: 8000 und 1: 16000).

Laminat B1

Typ: Nuklear

Molekulargewicht: 66 kDa

Lamine sind integrale Bestandteile der Kernschicht. Eine dichte, faserige Schicht, die auf ihrer nukleoplasmatischen Seite unter der Kernhülle liegt. Lamine spielen eine wichtige Rolle bei der strukturellen Integrität des Zellkerns und seiner Transport-Regulierung sowie bei der Interaktion mit der Chromatin- und Genexpression. Wirbeltierlamine bestehen aus zwei Typen (A und B). Das LMNB1-Gen kodiert für eines der zwei B-Typ-Proteine (Lamin B1) und kann als Ladungskontrolle für diejenigen verwendet werden, die mit Kernfraktionen arbeiten. Dieses Protein ist jedoch nicht für Proben geeignet, bei denen die Kernhülle entfernt wurde. Es ist auch erwähnenswert, dass Lamine während der Mitose phosphoryliert werden, wenn die Lamina-Matrix reversibel zerlegt wird. Der LMNB1-Antikörper von Proteintech (12987-1-AP) wurde gegen ein Proteinantigen (Aminosäuren 236 bis 586 am C-Terminus) erzeugt und ist für die Verwendung in Western Blot, IHC, ELISA und Immunfluoreszenz validiert.

PCNA

Typ: Nuklear

Molekulargewicht: 36 kDa

Proliferating-Cell-Nuclear-Antigen (PCNA) ist ein Prozessivitätsfaktor für die DNA-Polymerase δ. Es hilft, die eukaryotische DNA-Replikation zu kontrollieren indem die Fähigkeit Polymerase-Nukleotide zu verarbeiten während der Verlängerung des führenden Stranges erhöht wird. PCNA-Protein ist während der gesamten Evolution hochkonserviert worden - die Aminosäuresequenzen von Ratten und Menschen unterscheiden sich nur um 4 von 261 Aminosäuren - was bedeutet, dass Gesamtprotein-erhöhte Antikörper, die gegen PCNA gerichtet sind, über mehrere Spezies hinweg wirken sollten.

Die Mengen an PCNA variieren nicht mit dem Zellzyklusstatus in Säugerzellen, aber da es in proliferierenden Zellen häufiger vorhanden ist, wird PCNA hauptsächlich als Ladungskontrolle in Zellpopulationen verwendet, die einer Proliferation unterliegen. PCNA wird am besten vermieden, wenn Ihre Experimente DNA-Schäden induzieren, da dieses Protein schnell abgebaut wird wenn DNA-Schädigungswege ausgelöst werden.

Der PCNA-Antikörper von Proteintech ist ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der gegen eine interne Region menschlicher PCNA, die Aminosäuren 8-256 eingeschlossen, gerichtet ist.

Immunofluoreszenzanalyse von PCNA in HepG2-Zellen unter Verwendung von PCNA-Antikörper 10205-2-AP in 1:50 Verdünnung und FITC-markiertem Esel-Anti-Kaninchen-IgG (grün).

Tubulin

Typ: Ganze Zelle / zytoplasmatisch

Molekulargewicht: 50-55 kDa

Tubuline sind die Hauptkomponenten von Mikrotubuli, dem wichtigsten Transportnetzwerk in Zellen. Die Mikrotubuli sind an einer Vielzahl von zellulären Aktivitäten beteiligt, die von Mitose- und Transportereignissen bis hin zu Zellbewegungen und der Aufrechterhaltung der Zellform reichen. Über die Spezies hochgradig und stabil exprimiert und konserviert, ergeben Tubuline ausgezeichnete Western- Blotting-Kontrollen für Vollzell- oder zytoplasmatische Fraktionen. Die Tubulin-Expression kann jedoch in Abhängigkeit von der Resistenz gegenüber antimikrobiellen und antimitotischen Arzneimitteln variieren.

Proteintech hat polyklonale Antikörper gegen verschiedene Tubulin-Untereinheiten, einschließlich eines α-Tubulin-Antikörpers (11224-1-AP) und zwei β-Tubulin-Antikörper (10068-1-AP und 10094-1-Ap).