9 TIPPS, MIT DENEN SIE IHRE IF-EXPERIMENTE OPTIMIEREN

9 TIPPS, MIT DENEN SIE IHRE IF-EXPERIMENTE OPTIMIEREN

Sie möchten Ihre IF-Experimente optimieren? Unsere 9 Tipps helfen Ihnen,  eine erfolgreiche Immunofluoreszenz-Färbung durchzuführen

Tipps:

Einführung in die Immunofluoreszenz (IF)

Immunofluoreszenz (IF) ermöglicht die Detektion und Lokalisierung von Zellproteinen und anderen Antigenen über Antikörper im Zell- oder Gewebekontext.

Obwohl IF als Technik gut etabliert ist, haben wir einige nützliche Tipps für Sie vorbereitet, die Sie vor Beginn Ihres Experiments beachten sollten.

 IF-Tipp 1: Benutzen Sie das richtige Fixiermittel für Ihre Probe

Es gibt zwei beliebte Kategorien von Fixiermitteln: Aldehyde und organische Lösungsmittel.

Aldehyde  (Formaldehyd oder Glutaraldehyd) sind für die doppelte Markierung von membran- und zytoskelettgebundenen Antigenen geeignet und werden für nukleäre und mitochondriale Proteine empfohlen.

Empfohlener Fixierschritt:

10–20 Minuten bei Zimmertemperatur, Inkubation mit 2%–4% Paraformaldehyd (PFA), Abbildung 1.

Wichtig:

Diese Methode hat die chemische Modifikation von Proteinen zur Folge, die Antigene zerstören kann.

Eine Fixation mit Aldehyd erfordert möglicherweise einen zusätzlichen Bearbeitungsschritt, das sogenannte Quenchen, um die Autofluoreszenz zu reduzieren, die durch Reaktionen des Aldehyds mit Aminen und Proteinen entsteht.

Für Gewebe ist generell eine längere Fixation durch Aldehyd erforderlich als für Zellkulturen.

Organische Lösungsmittel (Methanol, Ethanol und Aceton) wirken durch Dehydrierung sowie durch Ausfällung von Proteinen. Sie werden für die Verwendung mit monoklonalen Antikörpern empfohlen, die lediglich an ein Epitop innerhalb von internen Proteinstrukturen binden.

Methanol eignet sich am besten für gefrorene Proben, da es die Zellarchitektur beibehält und die Sekundärstruktur von Proteinen stabilisiert. Allerdings besteht das Risiko eines Verlusts wasserlöslicher sowie Lipidkomponenten.

Aceton hat eine stark dehydrierende Wirkung und kann die irreversible Ausfällung von Gewebeproteinen verursachen. Für die histologische Konservierung ist Aceton besser geeignet als Methanol. Bei der Verwendung von Aceton erübrigen sich zusätzliche Schritte für die Permeabilisierung.

Abbildung 1. Paxillin-Antikörperfärbung (10029-1-Ig; 1:50; Grün) mit HepG2-Zellen. Die Zellen wurden mit 4% PFA fixiert, mit 0,2% Triton X-100 permeabilisiert und mit Tubulin ko-gefärbt (66031-1-Ig; 1:100; Rot), unter 40 x.

IF-Tipp 2: Wählen Sie das richtige Detergens für das Einfärben Ihres Ziels aus

- Bei der Fixierung mit Aldehyd müssen die Zellen permeabilisiert werden, damit die Antikörper in die Zellen eindringen können.

- Bei einer Fixierung auf Basis organischer Lösungsmittel entfällt dieser Schritt.

Antikörper können die Plasmamembran von mit Aldehyd fixierten, nicht permeabilisierten Zellen nicht durchqueren.  Um den Zugang zu intrazellulären Zielen zu ermöglichen, sind milde Reagenzien wie Digitonin, Leucoperm und Saponin erforderlich. Für das Färben von Innenmembranen (z.B. Nukleus, Mitochondrien) werden stärkere, nicht-ionische Detergenzien wie Triton X-100 oder NP-40 empfohlen (Abbildung 2).

Empfohlener Schritt für die Permeabilisierung:

- Zytosolische Ziele – 10-30 Minuten Inkubation bei Zimmertemperatur mit mildem Reagens (0,5 bis 1 mg/ml), als Stammlösung in DMSO vorbereitet

- Ziele in Innenmembranen – 10 Minuten Inkubation bei Zimmertemperatur mit 0,1%–0,2% Triton X-100 in PBS

Abbildung 2. Antikörper-Zugänglichkeit bei nicht permeabilisierten Zellen sowie bei mit mildem (Digitonin) und starkem, nicht-ionischem (Triton X-100) Detergens permeabilisierten Zellen.

Wichtig:

SDS ist ein nützlicher permeabilisierender Wirkstoff, mit dem eine leichte Denaturierung von fixierten Zellen erreicht werden kann. Auf diese Weise werden Epitope freigelegt, die eventuell maskiert und so vom Antikörper nicht erkannt wurden.  SDS kann auch kleine Proteine mit schwacher Vernetzung extrahieren. Für durch Ausfällung fixierte Proben (z.B. mit Methanol) sollte SDS allerdings nicht verwendet werden.

IF-Tipp 3: Verwenden Sie entsprechende Kontrollen

Verwenden Sie geeignete Negativkontrollen, um die Spezifität der Färbung zu verifizieren.

Einschließlich:

- Objektträger, die nur mit Sekundärantikörper gefärbt wurden (um die Schwelle des Hintergrundsignals festzustellen)

- Objektträger mit Zellen, auf denen das zu untersuchende Antigen nicht vorhanden ist

  IF-Tipp 4: Optimieren Sie Verdünnung und Zelldichte

Wählen Sie eine Zellanzahl aus, die zum Färbezeitpunkt eine Zellkonfluenz von ca. 50% aufweist.

- Bei einer zu hohen Zelldichte kommt es zu einer Verformung der Zellarchitektur, was zu verstärktem Hintergrund bei niedriger Vergrößerung führen kann.

- Bein einer zu niedrigen Zelldichte wird es schwieriger, das Feld mit dem optimalen Zellmuster zu finden.

Besondere Umstände für die Beschichtung

- Das Züchten von nicht haftenden und schwach befestigten Zellen auf Glasoberflächen gestaltet sich schwierig.  In einem solchen Fall sollten Sie das Deckglas mit Poly-Lysin oder extrazellulären Matrizen beschichten (z.B. Collagen oder Laminin).

- Für bestimmte Gewebearten (wie Blutgefäße oder Gehirnproben) sind möglicherweise Objektträger erforderlich, die mit Gelatine oder Poly-Lysin beschichtet wurden, damit sie auch nach mehreren Waschvorgängen auf dem Objektträger haften bleiben.

Wichtig:

1 μg/ml eines aufgereinigten Antikörpers oder Anti-Serum im Verhältnis 1:100 bis 1:1000 sollte ausreichen, um eine spezifische Färbung zu erzielen. Es empfiehlt sich, ein Titrationsexperiment durchzuführen, um die Antikörperverdünnung zu optimieren.

IF-Tipp 5: Verwenden Sie ein Blocking-Serum von einem anderen Organismus als dem, von dem der Primärantikörper stammt

Als Blocking-Puffer wird die einstündige Inkubation bei Zimmertemperatur mit entweder Rinderserumalbumin (1% -5%), Milchpulver oder Serum empfohlen.

Wichtig:

Beachten Sie unbedingt, dass die Blocking-Proteine nicht von derselben Spezies stammen dürfen, aus der der Primärantikörper stammt. Andernfalls geht die Spezifität des Sekundärantikörpers gegenüber dem Primärantikörper verloren.

Zum Beispiel kann im Falle eines Ziegen-Sekundärantikörpers, der gegen einen Maus-Primärantikörper gezüchtet wurde, normales Ziegenserum verwendet werden.

 IF-Tipp 6: Optimieren Sie Ihre Primär- und Sekundärantikörper

Üblicherweise werden Primärantikörper 1 bis 2 Stunden bei Zimmertemperatur oder über Nacht bei 4°C im Dunkeln inkubiert.

Beide Antikörper (Primär- und Sekundärantikörper) werden im Blocking-Puffer verdünnt.

- Bei direkter IF können Sie direkt mit dem Eindecken der Probe fortfahren, da der Primärantikörper sein Fluorochrom bereits mitbringt.

- Bei indirekter IF sind zusätzliche Schritte erforderlich, damit die markierten Sekundärantikörper an die Primärantikörper binden.

Wichtig:

Ein grundlegender Schritt hier ist das ausgiebige Waschen mit dem Primärantikörper nach der Inkubation, um die nicht spezifische Bindung aufgrund des Sekundärantikörpers zu reduzieren.

IF-Tipp 7: Mehrfachfärbung (optional)

- Jeder Primärantikörper muss in einer anderen Spezies gezüchtet werden. In der Folge ist es möglich, mit Fluorophoren konjugierte Sekundärantikörper zu verwenden, die von unterschiedlichen Kanälen erkannt werden.

- Alternativ dazu können Proben sequentiell doppelt gefärbt werden. In diesem Fall werden Blockierung sowie Primär- und Sekundärinkubation zuerst für ein Antigen und dann für das zweite Antigen durchgeführt.

IF-Tipp 8: Verwenden Sie ein Gegenfärbemittel, um Zellcharakteristika zu identifizieren

Gegenfärbemittel werden aus zwei Gründen verwendet:

- Um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren

- Um Zellorganellen zu identifizieren und Informationen zur Signallokalisierung zu liefern

Die häufigsten nukleären Gegenfärbemittel sind DAPI (Diamidino-2-Phenylindol), Hoechst 33342, Propidium-Iodid (PI) und Far Red Draq5. 

Empfohlene Inkubation für nukleäre Gegenfärbemittel:

5 Minuten bei Zimmertemperatur mit 0,1–1 μg/ml eines nukleären Gegenfärbemittels, mit zusätzlicher, ausgiebiger Waschung mit PBS (Abbildung 3).

Abbildung 3. IF-Ergebnis eines Anti-ATG5-Antikörpers (10181-2-AP; 1:50) mit kortikalen Neuronen aus der Maus (E15). Zellen wurden mit dem NF1-Antikörper (grün) unter 40x ko-gefärbt, mit 4% PFA fixiert und mit 0,2% Triton X-100 permeabilisiert.

 IF-Tipp 9: Decken Sie Ihre Proben richtig ein

Decken Sie Ihr Deckglas/Ihre Gewebeproben mit einem Tropfen des Eindeckmittels ein. Versiegeln Sie nun die Proben mit Nagellack, um das Austrocknen sowie das Verschieben unter dem Mikroskop zu verhindern (Abbildung 4). Nach der mikroskopischen Analyse sind die Proben dunkel bei -20°C oder +4°C zu lagern.

Abbildung 4. LC3B-spezifische Antikörperfärbung (18725-1-AP-Ig; 1:50; Grün) mit HepG2-Zellen. Die Zellen wurden mit 4% PFA fixiert, mit 0,2% Triton X-100 permeabilisiert und mit Tubulin ko-gefärbt (66031-1-Ig; 1:100; Rot), unter 40 x.