Wie SIe Ihr Western Blot optimieren

Perfekte, publikationsreife Ergebnisse sind beim Western-Blotting nicht unbedingt die Norm. Es gibt jedoch einige Schritte um Ihre Blotting-Experimente zu verfeinern und sicherzustellen, dass sie den bestmöglichen Start erhalten.

1. SDS-PAGE

Ihre Western-Blotting-Experimente beginnen lange bevor Sie mit Ihrer Membran arbeiten. Wenn Ihr Gel unsauber gemacht wird oder Sie es mit einer zu hohen Spannung arbeiten, werden Ihre Endergebnisse darunter leiden. Wenn Sie Ihre eigenen Gele gießen, achten Sie besonders auf die Einheitlichkeit ihrer Zusammensetzung. Wählen Sie den richtigen Acrylamid-Anteil und vermeiden Sie den "lächelnden" Farbeffekt, indem Sie der Versuchung widerstehen, Ihre Gele bei hohen Spannungen zu betreiben.

Laden Sie vor allem eine gleichmäßige Menge an Proteinen: Das Proteintech-Validierungslabor findet, dass 0-50 ug Protein eine geeignete Menge für den Nachweis der meisten Proteine sind und gewöhnlich streifenfreie und gut getrennte Banden ergeben.

2. Membran

Die Wahl der Membran kann für das Ergebnis Ihrer Western-Blotting-Experimente einen großen Unterschied ausmachen. Die beiden wichtigsten Membrantypen sind PVDF und Nitrozellulose, aber mittlerweile sind mehrere Versionen auf dem Markt verfügbar.

PVDF eignet sich für niedrig exprimierte Proteine, funktioniert besser mit hydrophilen / polar / geladenen Zielantigenen. Nitrocellulosemembrane eignen sich gut für normale oder stark exprimierte Proteine und funktionieren besser mit hydrophoben / nicht-polaren Antigenen.

3. Antikörperkonzentration

Ihr nächster Schritt sollte es sein, die optimale Antikörperkonzentration zu bestimmen. Die Anzahl der Bindungen zwischen Antikörper und Antigenen wird durch ihre relativen Konzentrationen in der Lösung (neben anderen Variablen) beeinflusst. Oft müssen Sie die Antikörperkonzentration optimieren, um bessere Blots zu erhalten. Dieser Schritt wird als Antikörper-Titration bezeichnet und sollte jedes Mal durchgeführt werden, sobald ein neuer Antikörper verwendet wird oder sich die Versuchsbedingungen ändern.

"Oft müssen Sie die Antikörperkonzentration optimieren, um bessere Blots zu erhalten."

4. Blockieren beim Western Blot

Nicht alle verfügbaren Blocking-Puffer eignen sich für jede Situation. Es ist wichtig, dass Sie mehrere Puffer für jedes Antikörper-Antigen-Paar ausprobieren. Denken Sie daran, dass Blocking-Puffer auf Milchbasis endogenes Biotin, Glykoproteine und Enzyme enthalten können die das Signal stören könnten. Auf Milch basierende Puffer enthalten beispielsweise aktive Phosphatasen, die Ihren Nachweis von phosphorylierten Proteinen verfälschen. Greifen Sie in diesen Fällen auf Alternativen wie Rinderserumalbumin basierende Blocker zurück.

"Denken Sie daran, dass Blocking-Puffer auf Milchbasis endogenes Biotin, Glykoproteine und Enzyme enthalten können die das Signal stören könnten."

5. Waschen

Wenn der Western-Blot einen hohen Hintergrund zeigt, hat sich eine Überprüfung der Waschschritte beim nächsten Durchlauf als sinnvoll erwiesen. Wollen Sie das Hintergrundsignal abschwächen, erhöhen Sie die Waschzeiten und -volumina, ändern Sie die Puffer oder Verwenden Sie eine stärkere Detergens (z. B. SDS anstelle von Tween 20).

6. Erkennung

Die Detektion ist ein integraler Bestandteil um ein gutes Western-Blot-Signal zu erhalten. Es gibt viele Chemilumineszenzreagenzien und chemilumineszierende Alternativen wie die Fluoreszenzdetektion - Sie haben also viele Möglichkeiten, sollte Ihre derzeitige Nachweismethode Laborstandards nicht erfüllen. Sie können z. B. Reagenzien mit höherer Empfindlichkeit wählen. Oder solche, die ein länger anhaltendes Signal erzeugen. Die letztere. Die letztere Wahl wird die Reproduzierbarkeit von Flecken unermesslich erhöhen. Eine einfachere Methode besteht darin, mit Filmbelichtungszeiten zu experimentieren. Dies ist wahrscheinlich der am häufigsten durchgeführte Optimierungsschritt, da er schnell und einfach ist. Belichten Sie Ihre Blots immer mit einer Reihe individueller Zeiten.