Wahl des richtigen Lysepuffers

Protein Lysate vorbereiten

Zelllyse ist der Abbau der Zellmembran und die Trennung von Proteinen von den nicht löslichen Teilen der Zelle. Lysatpuffer enthalten verschiedene Detergenzien die dabei helfen, lösliche Proteine ​​freizusetzen (Triton-X, Tween, SDS, CHAPS).

Abhängig davon, welches Protein von Interesse für Sie ist, wird ein anderer Lysatpuffer benötigt um eine hohe Ausbeute und Reinheit des Proteins zu erhalten.

Jedoch ist jedes Protein anders und kann auch unterschiedlich mit den Puffern und den Detergenzien reagieren. Wenn Sie Ihr Protein nicht in Lösung bringen oder eine spezielle Protein-Protein-Wechselwirkung untersuchen, können Sie verschiedene Puffer ausprobieren und die Detergenzien austauschen.

Allgemeine Richtlinien

Ganzzelllysat / membrangebundene Proteine

Die meistverwendeten Puffer sind RIPA und NP-40. Die grobe Beschaffenheit des RIPA-Puffers ist besonders gut für schwer lösliche Proteine ​​geeignet.

RIPA: 25 mM Tris, HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS

NP-40: 50 mM Tris, HCl (pH 8,5), 150 mM NaCl, 1% Detergens

Kern- / Mitochondrien-Proteine

RIPA ist hier die bevorzugte Wahl. Es werden häufig Teilprotokolle verwendet um die Konzentration des gewünschten Proteins zu erhöhen.

Cytoplasmatische Proteine

Eine Tris-HCl-Lyse hat manchmal Vorteile gegenüber einem RIPA-Puffer. Für das Protein von Interesse sollten die optimalen Bedingungen getestet werden.

Vergessen Sie nicht Ihre Hemmstoffe

Die Denaturierung / Proteolyse und Dephosphorylierung (bei Phosphoproteinen) sollte immer auf ein Minimum beschränkt und dem Zelllysat (EDTA, Natriumorthovanadat, PSMF, Aprotinin) frisch zugegeben werden.