So optimieren Sie Ihre Ergebnisse mit Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht

An beiden Enden des Molekulargewichts (MW) -Spektrums leiden reguläre SDS-PAGE- und Western-Blot-Techniken unter Einschränkungen: schlechte Trennung, Signalreduktion oder sogar eine vollständige Abwesenheit von Zielbanden. Low-MW-Proteine (<20 kDa) sind schwer zu entdecken. Hier sollten verschiedene Protokolländerungen genutzt werden, um ihre Retention und Auflösung zu verbessern.

Verwenden Sie Tricin

Im Allgemeinen sind Glycingele gut zum Auflösen von Proteinen geeignet, die im MW-Bereich von 30 bis 250 kDa liegen. Acrylamid-Gele, die auf ein Tris-Tricine-Puffersystem basieren, verbessern erheblich Ihre Chancen, Ihr(e) Zielband(en) zu “sehen” wenn Sie unterhalb des 30 kDa-Bereichs arbeiten.

(Sie finden ein Rezept für ein 15% Tricine Gel im Abschnitt "Tricine Gel Rezept für Low-MW-Proteine".)

Abbildung: Vergleich der Tricin (A) - und Glycin-SDS-PAGE (B) - Abtrennung von Myoglobinfragmenten. Nach Schägger und von Jagow 1987.

Weshalb es funktioniert

Der Unterschied in den Trennungs-Fähigkeiten von Glycin- und Tricin-Gelen wird den unterschiedlichen Eigenschaften der Glycin- und Tricin-Verbindungen zugeschrieben, wie ihren pK-Werten und ionischen Beweglichkeiten. Tricin eignet sich besser für die Trennung von Proteinen mit niedrigem MW, da es Proteine ​​in gleichmäßigen Banden "stapelt". Eine Tricine-basierte Stapelschicht verschiebt die obere Stapelgrenze auf niedrige 30 kDa für den ersten Stapel 1, verhindert so eine Überlastung an der Grenzfläche zwischen den Gelschichten.

Proteintransfer

Neben der optimalen Trennung von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht müssen Sie auch auf die Proteinübertragung achten. Proteine ​​mit niedrigem Molekulargewicht sind anfällig für “übermäßige Transfers”/”overtransfer” - ein Verlust der Probe aufgrund von fehlender Retention durch die Transfermembran und / oder zu schneller Übertragung ist die Folge.  

Membranwahl und Porengröße

Die meisten Labore bevorzugen eine bestimmte Western-Blotting-Membran. Jedoch ist bei kleineren Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht, aufgrund seiner besseren Fähigkeit Proteine ​​zu binden, PVDF die bessere Wahl. Es gibt verschiedene Membranporengrößen - wählen Sie eine kleinere Porengröße, um eine bessere Übertragung Ihrer niedermolekularen Zielproteine ​​zu erreichen.

Übertragungsbedingungen

Neben der Wahl der Membran spielen Faktoren wie das Transfersystem, die Länge, die Temperatur und die Pufferzusammensetzung eine Rolle wenn es sich um Proteine ​​mit niedrigem Molekulargewicht handelt. Bei kleinen Proteinen ist weniger oft mehr sobald es um Übertragungslänge und -spannung geht. Wie stark Sie diese anpassen sollten, hängt von der Marke und dem Modell des verwendeten Systems ab.

Weitere Tipps

Beachten Sie, dass einige Proteine ​​die Farbstofffront des Probenladepuffers verlassen. Sie können Ihr Gel 5 Minuten lang in einem SDS-freien Puffer (oder H2O) einweichen bevor Sie mit der Übertragung beginnen. Dies hilft bei der Entfernung von SDS, das kleine Proteine ​​und Proteinfragmente in negative Ladungen einhüllt und deren Durchtrittsrate durch die Western-Blot-Membran erhöht.