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Problembehandlung: Hoher Hintergrund

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Hoher Hintergrund (gleichmäßige Verteilung)

Die Antikörperkonzentration ist zu hoch

  • Verwenden Sie eine höhere Antikörperverdünnung.
Unzureichendes Blockieren

  • Erhöhen Sie die Konzentration der Blockierungsreagenz (z. B. von 5 bis 7%).

  • Erhöhen Sie die Blockierzeit und / oder die Temperatur.

  • Fügen Sie dem Blockierungspuffer Tween 20 hinzu.

  • Beziehen Sie die Blockierungsreagenz und Tween 20 im primären Antikörper-Verdünnungspuffer mit ein.

Unzureichende Wäsche
  • Waschzeit und -volumen erhöhen.
Trockene Membran
  • Stellen Sie sicher, dass die Membran während des Immunoblots nicht austrocknet.
Unspezifische Bindung von sekundären Antikörper

  • Führen Sie ein sekundäres Antikörper-Kontrollexperiment durch (lassen Sie den primären Inkubationsschritt weg).

  • Verwenden Sie einen voradsorbierten sekundären Antikörper mit reduzierter Kreuzreaktivität zu unerwünschten Gattungen.

  • Verwenden Sie zum Nachweis von phosphoryliertem Proteinen keine Milchpuffer wie fettfreie Milch oder Kaseinpuffer (Milch und Casein sind phosphoproteinreich).

Filmbelichtung zu lang / Erkennungsreagenz zu empfindlich
  • Prüfen Sie verschiedene Typen und Verdünnungen der Nachweisreagenz.
 
Hoher Hintergrund (unspezifische Banden)

Die Tipps zur Problembehandlung bei einem hohem Hintergrund (mit gleichmäßiger Verteilung) können auch auf Fälle angewendet werden, in denen nichtspezifische aber unterschiedliche Banden auf der Western Blot-Membran auftreten.

Zusätzlich sollte folgendes berücksichtigt werden:

Die Zielproteinhäufigkeit ist niedriger als die Schwelle der unspezifischen Bindung.

  • Laden Sie mehr Protein pro Vertiefung in die SDS-PAGE.

  • Reichern Sie Proteine mit geringer Häufigkeit durch Immunpräzipitation, Fraktionierung usw.

Probenabbau

  • Bereite Sie jedes Mal frische Lysate zu

  • Verwenden Sie eine frisch zubereitete Probe, die bis zur Zugabe von Probenpuffer mit Eis gekühlt wird. Erhitzen Sie die Probe für 5-10 Minuten auf 95 ° C.

  • Gewebeextrakte neigen dazu, mehr unspezifische Banden und Abbauprodukte zu produzieren. Verwenden Sie frische, beschallte und deutliche Gewebeextrakte.

  • Schließen Sie immer Protease-Inhibitoren (und Phosphatase-Inhibitoren für den Nachweis von phosphorylierten Targets) ein.

  • Stellen Sie sicher, dass die Probe nicht abgebaut wurde.

Interferenzen von anderen Isoformen

  • Überprüfen Sie das Vorhandensein bekannter Isoformen in der Literatur oder auf uniprot.org.

  • Verwenden Sie einen Isoform-spezifischen Antikörper.

Ineffiziente SDS-PAGE-Trennung

  • Ändern Sie den Gelanteil so, dass er dem Molekulargewischt des Zielproteins entspricht.

  • Niedrigprozentige Tris-Glycin-Gele oder Tris-Acetat-basierte Gele und Puffer sollten für größere Proteine verwendet werden. (siehe Seite 12 für unsere SDS-PAGE-Gelrezepte). 

  • Hochprozentige Tris-Glycin-Gele (bis zu 15%) sollten für kleinere Proteine ​​(<20 kDa) oder Tris-Tricin-Gele verwendet werden.

Vorhandensein von posttranslationalen Modifikationen
  • Kennen Sie Ihr Protein von Interesse, können sich die Bandengrößen aufgrund von Glykosylierung, Phosphorylierung, Reifung der Vorläuferzellen usw. verschieben.
Mangel an Kontrollen

Wenn auch das Auslassen von Kontrollproben aus einem Western-Blot nicht die Ursache für unspezifische Banden ist, können sie erklären, warum Sie sie auf Ihrer Membran sehen. Kontrollelemente die Sie einbeziehen können:

Positivkontrollen:

Negative Kontrollen: