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Problembehebung bei IHC

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Problembehebung bei IHC

Keine/schwache Färbung

Mögliche Ursache Test- bzw. Lösungsvorschlag
Der Primär-/Sekundärantikörper hat seine Aktivität eingebüßt. Verwenden Sie neue Antikörper.Antikörper wurde nicht sachgemäß gelagert. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Normalerweise sind Einweg-Aliquote herzustellen und bei -20°C zu lagern.Übermäßige Gefrier-/Auftauvorgänge haben den Antikörper beschädigt.
Bedingungen für den Antikörper wurden nicht optimiert. Titrieren Sie die Antikörperkonzentration, um die Arbeitsbedingungen zu optimieren.Inkubieren Sie den Primärantikörper bei Zimmertemperatur oder über Nacht bei 4°C.
Das zu untersuchende Protein wird im verwendeten Gewebe nicht exprimiert. Führen Sie eine Positivkontrolle durch.
Das zu untersuchende Protein wird in den verwendeten Zellen nicht exprimiert. Verwenden Sie bei der Visualisierung eine Signalverstärkung.
Beschädigtes Epitop. Steigen Sie auf einen anderen Puffer/eine andere Technik für die Antigenrückgewinnung bei in Paraffin eingebetteten Proben um.
Der Antikörper ist für diese Anwendung nicht geeignet. Überprüfen Sie die Validierungsdaten des Herstellers.

 

Hintergrundfärbung/ Nicht spezifische Färbung
Mögliche Ursache Lösungsvorschlag
Zu hohe Konzentration von Primär-/Sekundärantikörpern. Antikörper titrieren, um die optimale Arbeitskonzentration festzustellen.
Nicht-spezifische Bindung von Primär-/Sekundärantikörpern. Blockierschritt verlängern; Konzentration der Blockierlösung erhöhen. Positive und negative Kontrollen durchführen.
Nicht-spezifische Bindung von Sekundärantikörpern. Kontrolle nur mit Sekundärantikörper durchführen. Auf krezuadsorbierten Sekundärantikörper oder Fragmentantikörper
Probe wurde nicht ausreichend gewaschen. Waschvorgang wiederholen oder verlängern.
Temperatur/Dauer der Antikörperinkubation passt nicht. Bedingungen optimieren.
Beschädigtes Epitop. Steigen Sie auf einen anderen Puffer/eine andere Technik für die Antigenrückgewinnung um. bei in Paraffin eingebetteten Proben um.

 

Ungünstige Zellmorphologie
Mögliche Ursache Lösungsvorschlag
Unsanfte Bedingungen bei der Antigenrückgewinnung Optimieren Sie Puffer, Temperatur, pH-Wert, Inkubationszeit,
Unklare Gewebestruktur Optimieren Sie die Dicke der Gewebsschnitte. Fertigen Sie neue Schnitte an.
Gewebe haftet nicht richtig am Objektträger Optimieren Sie die Fixation. Verringern Sie die Heizdauer oder Temperatur während HIER.
Physisch beschädigte Zellform Nicht ausreichend fixiert. Steigen Sie auf eine anderes Fixationsmittel bzw. eine andere Fixationszeit um.