IHC mit gefrorenem Gewebe
Immunohistochemie mit gefrorenem Gewebe
Im Gegensatz zu Paraffinproben werden gefrorene Gewebsproben nicht mit einem Fixationsmittel behandelt. Daher werden die Antikörper auch nicht mit anderen Proteinen vernetzt, was bedeutet, dass der Schritt der Antigenrückgewinnung, der die Antigene demaskiert und sie in der Folge für die Antikörper erkennbar macht, entfällt.
Für die rasche Bearbeitung von klinischen Proben wird die Eliminierung der Fixation und das direkte Einfrieren und Einbetten mit OCT empfohlen, gefolgt vom Schneiden der Proben (6-8 μm Dicke). Dies spart nicht nur Zeit, sondern umgeht auch die Schwierigkeiten beim Schneiden, die sich häufig als Folge des Fixationsvorgangs ergeben. Die nachstehende Tabelle gibt Aufschluss über die Temperatur im Kryostat für nicht fixiertes Gewebe:
| Kryostat-Temperatur für nicht fixiertes Gewebe | |
| Gewebe aus Gehirn, Leber und Lymphknoten | -10ºC/-15ºC |
| Gewebe aus Schilddrüse, Milz, Niere und Muskel | -15ºC/-20ºC |
| Fetthaltiges Gewebe | -25ºC |
| Stark fetthaltiges Gewebe | -30ºC |
IHC mit gefrorenem Gewebe: Arbeitsschritte
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Waschen Sie das Gewebe drei Mal jeweils 5 Minuten lang mit PBS.
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Legen Sie das Gewebe 16-48 Stunden lang in 20-30% Sukrose ein.
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Legen Sie den Gewebeblock in eine vormarkierte Ausgießform.
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Decken Sie den gesamten Gewebeblock mit einem Kryo-Eindeckmittel ein (z.B. OCT).
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Tauchen Sie die Ausgießform mit dem Gewebeblock langsam in Flüssigstickstoff ein, sodass der gesamte Gewebeblock vollständig eingetaucht und gefroren ist.
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Lagern Sie den gefrorenen Gewebeblock bei -80ºC, bis er geschnitten werden soll.
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Transferieren Sie den gefrorenen Gewebeblock vor dem Schneiden in einen Kryotom-Kryostat (z.B. -20ºC) und warten Sie, bis die Temperatur des gefrorenen Gewebeblocks mit der Temperatur des Kryotom-Kryostats äquilibriert.
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Schneiden Sie den gefrorenen Gewebeblock in der gewünschten Dicke. Säubern Sie die Schneideutensilien, einschließlich Klinge und Halter, mit einem weichen Papiertuch.
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Platzieren Sie die Schnitte auf Objektträger aus Glas, die für Immunohistochemieanwendungen geeignet sind. Die Schnitte können in einer versiegelten Einschubkassette bei -80ºC für die spätere Verwendung aufbewahrt werden. Vor der weiteren Verwendung müssen die Gewebeschnitte 30 Minuten lang bei -20°C äquilibrieren.