IHC-Blockierung
Was ist das Blockieren bei immunohistochemischen Anwendungen?
Der Blockiervorgang ist unabkömmlich, um eine nicht spezifische Bindung von Antikörpern oder anderen Reagenzien an das Gewebe zu vermeiden. Selbst dann, wenn der Antikörper eine hohe Spezifität gegenüber dem Ziel aufweist, können intermolekuläre Kräfte eine nicht spezifische Bindung an andere Moleküle begünstigen. Diese nicht-spezifische Bindung verhindert die Visualisierung der Antigen-Antikörper-Bindung, die untersucht werden soll. Um eine nicht-spezifische Bindung nach Möglichkeit auszuschließen, muss ein Blockiervorgang vor der Inkubation mit dem Primärantikörper durchgeführt werden.
Arten der IHC-Blockierung
Blockierung von nicht-spezifischen, ionischen Bindungen
Nicht-spezifische, ionische Bindungen können z.B. durch Van der Waals-Interaktionen, Dipol-Dipol-Interaktionen oder Nettoladungen von Aminosäuregruppen entstehen. In einem solchen Fall kann eine Änderung der ionischen Stärke des Antikörper-Verdünnungspuffers zu einer Reduktion der nicht-spezifischen, ionischen Bindungen führen.
Blockierung von endogenen Enzymen
Wird ein mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) oder mit alkalischer Phosphatase (AP)-konjugierter Antikörper für die Detektion eingesetzt, müssen die endogenen Enzyme blockiert werden. Dies bezieht sich normalerweise auf Gewebearten wie Niere, Leber, Darm, Lymphgewebe etc. Die Peroxidase kann mit Puffern blockiert werden, die H₂O₂ enthalten; AP hingegen mit Essigsäure oder Levamisol-hältigen Puffern.
Blockierung von Proteinen
Generell wird Serum (von derselben Spezies wie der Sekundärantikörper) oder Rinderserumalbumin (BSA) für die Blockierung verwendet. Seren und BSA können helfen, die nicht-spezifische Bindung an die zahlreichen hydrophoben Seitenketten im Gewebe zu verhindern. Wenn Sie eine Färbung mit mehreren Antikörpern durchführen, müssen Sie Blockserum gegen alle verwendeten Sekundärantikörper benutzen. Bei Verwendung von BSA kann die Zugabe von 0,1–0,5% Triton-X oder Tween bei der Vermeidung der nicht-spezifischen Bindung helfen.
Tipps für das Blockieren bei IHC
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Wählen Sie bei der Arbeit mit Ihren negativen und positiven Kontrollproben die beste Blockierlösung aus, um die Schwelle für die Hintergrundfärbung zu bestimmen.
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Verwenden Sie Ihre Blockierpuffer, um Ihre Antikörperverdünnung vorzubereiten.
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Stellen Sie sicher, dass der Blockierpuffer Ihre Methode für die Signalerkennung nicht beeinträchtigt.