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IHC auf Paraffinschnitten

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Immunohistochemie auf Paraffinschnitten

Wichtig: Sofern nicht anders angegeben, sind alle im folgenden Protokoll angeführten Schritte bei Zimmertemperatur durchzuführen.

Entparaffinierung und Rehydration

  1. Legen Sie die Gewebsschnitte 10 Minuten lang in Xylol ein. Wiederholen Sie diesen Schritt mit frischem Xylol für weitere 10 Minuten.

(Falls erforderlich, kann der Gewebsschnitt auch ein drittes Mal in frisches Xylol eingelegt werden).

  1. Rehydrieren Sie die Schnitte, indem Sie sie der Reihe nach jeweils 5 Minuten lang mit 100%, 95%, 80% und 60% Ethanol inkubieren.

  2. Spülen Sie die Schnitte jeweils 3 Minuten lang und drei Mal hintereinander mit destilliertem Wasser.

 

Hitze-induzierte Epitoprückgewinnung (HIER) (optional)

  1. Legen Sie die Schnitte in einen Behälter und decken Sie sie mit ausreichend Zitratpuffer mit ph 6,0* ein.

  2. Erhitzen Sie sie in der Mikrowelle 10 Minuten lang bei mittlerer Leistung.

  3. Lassen Sie die Schnitte im Puffer ca. 35 Minuten lang abkühlen.

* Oder Tris-EDTA-Puffer (pH9). Die optimalen Bedingungen sind von jedem Labor individuell zu bestimmen und müssen auch die spezifischen Produktinformationen berücksichtigen.

Primärantikörper-Inkubation

  1. Spülen Sie die Schnitte drei Mal jeweils 3 Minuten lang mit 1x TBS.

  2. Inkubieren Sie die Schnitte 10 Minuten lang mit 3% H₂O₂-Lösung (in destilliertem Wasser verdünnt), um die endogene Peroxidaseaktivität zu quenchen.

  3. Spülen Sie die Schnitte drei Mal jeweils 3 Minuten lang mit 1x TBS.

  4. Bereiten Sie 5% normales Blockserum in 1x TBS zu. Das Serum muss von der Spezies stammen, in der auch der Sekundärantikörper gezüchtet wurde. Blockieren Sie die Schnitte 1 Stunde lang.

(Alternativ können Sie auch für das Blockieren auch 5% BSA in 1x TBS verwenden, falls kein entsprechendes Serum zur Verfügung steht.)

Inkubieren Sie die Schnitte 1,5 Stunden lang mit dem in 1x TBS verdünntem Antikörper, oder über Nacht bei 4°C. Das optimale Verdünnungsverhältnis des Antikörpers muss durch Experimentieren bestimmt werden. Bereiten Sie Ihre Negativkontrollen vor, indem Sie bei jeweils einem Schnitt pro Durchgang den Primärantikörper nicht inkubieren.

Spülen Sie nach der Inkubation des Primärantikörpers die Schnitte drei Mal jeweils 3 Minuten lang mit 1x TBS.

Signalerkennung

Wichtig: Proteintech®* verwendet routinemäßig EnVision Kit (Dako) für diesen Schritt.

  1. Fügen Sie ausreichend mit Peroxidase markiertes Polymer hinzu und inkubieren Sie die Schnitte 30 Minuten lang.

  2. Spülen Sie die Schnitte drei Mal jeweils 3 Minuten lang mit 1x TBS.

  3. Bereiten Sie vor der Verwendung eine ausreichende Menge der Substratlösung vor, indem Sie einen Tropfen flüssiges DAB plus Chromogen sofort mit 1 ml des Substratpuffers vermischen. Tragen Sie das Substrat vorsichtig auf und inkubieren Sie die Schnitte 5-10 Minuten lang, bis eine bräunliche Farbe entsteht.

  4. Spülen Sie die Schnitte vorsichtig mit einer ausreichenden Menge destillierten Wassers.

Gegenfärbung mit Hämatoxylin (optional)

  1. Um Zellkerne zu färben, tauchen Sie die Schnitte 3 Minuten lang in ein Hämatoxylinbad.

  2. Spülen Sie die Schnitte vorsichtig mit destilliertem Wasser.

  3. Legen Sie die Schnitte 10 Sekunden lang in eine Lösung mit 1% HCl und 99% Ethanol ein und transferieren Sie sie dann umgehend in destilliertes Wasser.

Dehydration und Eindecken

  1. Rehydrieren Sie die Schnitte, indem Sie sie der Reihe nach jeweils 5 Minuten lang mit 60%, 80%, 95% und 100% Ethanol inkubieren.

  2. Legen Sie die Gewebsschnitte 5 Minuten lang in Xylol ein. Wiederholen Sie diesen Schritt mit frischem Xylol für weitere 5 Minuten.

  3. Decken Sie den Schnitt mit einer ausreichenden Menge Eindeckmittel ein und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab. Lassen Sie den Schnitt in einem gut belüfteten Bereich lufttrocknen (z.B. im Abzug).

Tipp: Metallionen (z.B. CuSO4, Methenamin-Silber, Kobaltchlorid, Ammonium-Nickelsulfat, Nickelchlorid) können das IHC-Signal verstärken.

Tipp: Bei nukleärer DAB-Markierung muss die Inkubationszeit für die Gegenfärbung verkürzt und der Schnitt mit Ammoniak oder TBS-Puffer gewaschen werden (pH 8,0).